آشنایی با سل کانترهای هماتولوژی دارای قابلیت پارشیال دیف سلولهای سفید
مهندس امیر حسین بحرالعلومیان - شرکت مهندسی تجهیزات آزمایشگاهی پیشرفته
مقدمه :
آنالاریزهای هماتولوژی یا سل کانترها، دستگاههای تمام اتوماتیکی هستند که برای اندازهگیری کمی پارامترهای خون در آزمایشگاههای پزشکی مورد استفاده قرار میگیرند، وظیفه اصلی این دستگاهها تهیه گزارش سریع و دقیق به روشی ساده از پارامترهای اصلی خون است، به نحوی که نمونههای غیر طبیعی از نمونههای طبیعی تفکیک گردیده و جهت انجام بررسیهای بیشتر آنها از روشهای متداول دیگر کمک گرفته میشود.اجزای اصلی سلکانتر
سلکانتر معمولاً از سه بخش اصلی هیدرولیک، پنوماتیک و الکترونیکی تشکیل میشود.
وظایف سیستم هیدرولیک :
وظایف سیستم هیدرولیک شامل برداشت محلولهای مورد نیاز دستگاه و نمونه خون یا Aspirating، تخلیه محلولها یا خون برداشت شده یا Dispensing، رقیقسازی نمونه یا Diluting ، مخلوط کردن نمونه و محلولها یا Mixing و افزودن محلول لیز کننده به نمونه یا Lysing است.
وظایف سیستم پنوماتیک :
وظیفه اصلی سیستم پنوماتیک تولید خلاء یا فشار ثابت جهت کنترل دریچهها و همچنین کنترل حرکت محلولها و نمونه در داخل سیستم هیدرولیک است.
وظایف سیستم الکترونیکی :
این سیستم توسط یک ریزپردازنده (میکروپروسسور) کنترل میشود و وظایف زیر را به عهده دارد :
1) اندازهگیری و پردازش سیگنالهای حاصل از تغییر امپدانس
2) محاسبه و انتقال نتایج به چاپگر یا هر خروجی دلخواه در سیستم
3) ترسیم گرافپارامترهای اصلی
4) کنترل زمان اندازهگیری وتوالی تستها
5) اجرای برنامه Q.C و کالیبراسیون سیستم
6) ذخیره و بازیابی(save and Load) نتایجمحلولها و مواد مورد نیاز در دستگاه سلکانتر

الف) محلول ایزوتون یا Diluent : برای رقیق کردن خون از یک محلول ایزوتونیک که میتواند محیطی شبیه پلاسمای خون را تأمین نماید، استفاده میشود بدین ترتیب یک رسانای مناسب جهت شمارش سلولهای خونی ایجاد میگردد.
ب) محلول لیز کننده یا Lyse : از این محلول برای از بین بردن غشاء سلولهای قرمز در کاپیلاری مخصوص شمارش WBC استفاده میشود، بدین ترتیب تداخل اندازه بین سلولهای قرمز و سفید در شمارش آنها از بین میرود.
همچنین از جذب نوری مخلوطی که از لایزوهموگلوبین تشکیل گردیده است، برای اندازهگیری غلظت هموگلوبین استفاده میشود.
ج) محلول شستشو یا Rinse : محلول شستشو نوعی دترجنت است که برای شستشوی تیوب ها و کاپیلاریها و مرطوب نگه داشتن آنها پس از هر سیکل اندازهگیری مورد استفاده قرار میگیرد.
د) محلول شستشوی آنزیماتیک یا E-Z Cleanser : یک محلول آنزیمی مخصوص است که برای پاک کردن بهتر تیوبها و کاپیلاریها به صورت روزانه مورد استفاده قرار میگیرد(قبل از خاموش کردن دستگاه) و ضرری برای قسمتهای پلاستیکی دستگاه ندارد.
هـ) محلول پاککننده پروبها یا Probe Cleanser : از این محلول برای پاک کردن و حل کردن لخته سلولهای خونی دارای اندازههای مختلفی هستند، بر اساس این اندازهها، هر سلول که از درون روزنه عبور نماید، موجب افزایش امپدانس الکتریکی بین دو الکترود میشود، بدین ترتیب میتوان امپدانسهای ایجاد شده را به سلولهای مختلف مشخص نسبت داد.
خونها بجای مانده در پروبها و تیوبها و کلاپیلاریهای دستگاه استفاده میشود و معمولاً این محلول باید 15 دقیقه در این مسیر قرار گیرد تا مؤثر واقع شود.
و) کالیبراتور : یک محصول خونی با پارامترها و مقادیر مشخص و ثابت است که به صورت تجاری و مطابق با استانداردهای مرجع پزشکی تولید میشود و از آن برای کالیبره کردن دستگاه سل کانتر استفاده میشود.
ز) کنترل : یک محصول خونی با پارامترها و مقادیر مشخص و ثابت است که به صورت تجاری در سه نوع Low، Normal و High تولید میشود خون کنترل باید روزانه برای چک کردن عملکرد دستگاه سلکانتر مورد استفاده قرار گیرد.اصول شمارش سلولهای خونی
نمونهرقیق شده آماده اندازهگیری توسط یک فشار منفی به داخل روزنه WBC و RBC مکش میشود، در سیستم اندازهگیری، یک لوله شیشهای دقیق که لولهاندازهگیری نامیده میشود، وجود دارد که وظیفه آن کنترل ثابت بودن حجم نمونه مورد اندازهگیری در طول یک سیکل شمارش است. در بالا و پایین این لولهاندازهگیری دو سنسور نوری قرار داده شده که فاصله بین این دو سنسور،حجم نمونه مورد اندازهگیری را مشخص مینماید و از آنجایی که این فاصله، همیشه ثابت است، حجمهای اندازهگیری شده در دیسکهای مختلف شمارش نیز ثابت است. سلولهای سفید خون(WBC)، سلولهای قرمز خون(RBC) و پلاکتها به روش امپدانسالکتریکی شمارش شده و سایزبندی میشوند، این روش بر اساس اندازهگیری تغییرات در مقاومت الکتریکی بین دو الکترود مثبت و منفی پایهگذاری شده است. شایان ذکر است که تغییرات در مقاومت الکتریکی بین دو الکترود، ناشی از عبور ذرات و سلولهای خونی با اندازههای مختلف از روزنه بین الکترودهای مثبت و منفی است، الکترودها در زیر سطح محلول در دو طرف یک روزنه که Aperture نامیده میشود، قرار داده شدهاند و تشکیل یک مسیر الکتریکی را میدهند.
سلولهای خونی دارای اندازههای مختلفی هستند بر اساس این اندازهها، هر سلول که از درون روزنه عبور نماید، موجب افزایش امپدانس الکتریک بین دو الکترود میشود، بدین ترتیب میتوان امپدانسهای ایجاد شده را به سلولهای مختلف مشخص نسبت داد. در شکل (1) محل الکترودها و روزنه مسیر عبور سلولهای خونی نشان داده شده است.
دستگاه سلکانتر، سلولهای خونی را به تنهایی شمارش و بر اساس اندازه دستهبندی مینماید، حجم مشخصی از نمونه رقیق شده آماده قرائت از روزنه 70 میکرومتری RBC و نیز از روزنه 100 میکرومتری WBC عبور نموده و شمارش انجام میگردد، همچنین یک سیستم نوری برای قرائت هموگلوبین در دستگاه سل کانتر طراحی شده است. همانطور که ذکر شد، یک سیستم نوری جهت کنترل و ثبت حجم اندازهگیری در هر سیکل شمارش طراحی شده است، مطابق شکل(2)،این سیستم دارای دو سنسور نوری است، وقتی محلول آماده شمارش از سنسور بالایی عبور مینماید، سیکل شمارش آغاز میگردد و با عبور از مقابل سنسور پایینی این شکل خاتمه مییابد، لذا در کلیه سیکلهای شمارش حجم ثابت و مشخصی از محلول، آماده
شمارش میشود، بنابراین اگر یک حباب و یا یک جریان غیر طبیعی نظیر لخته خون در محلول آماده وجود داشته باشد، سیستم سریعاً اخطار میدهد و اپراتور متوجه خطا در شمارش میگردد.رقیق سازیDILUTION :
درخون کامل سلولها بسیار نزدیک به یکدیگر هستند، بنابراین برای جداسازی و روانسازی آن باید از یک محلول رقیق ساز ایزوتونیک استفاده کنیم.
در سلکانترهایی که به روش امپدانس اکلتریکی کار میکنند، به دو روش میتوان سیکل اندازهگیری را آغاز نمود.روش اندازهگیری خون کامل :
در این روش 13 میکرولیتر از خون کامل توسط دستگاه مکش میشود، سپس با 5/3 میلیلیتر محلول ایزوتون رقیق میگردد،(1:269 نسبت رقیق سازی اولیه) سپس این محلول رقیق شده به دو قسمت تقسیم میگردد: الف) 6/15 میکرولیتر از محلول رقیقشده اولیه مکش میشود و با 6/2 میلیلیتر محلول ایزوتون مجدداً رقیق میگردد.(رقیق سازی ثانویه 1:44833)این محلول برای شمارش سلولهای قرمز خون(RBC) و پلاکتها (PLT) مورد استفاده قرار میگیرد. ب) بقیه محلول رقیق شده با نیم میلیلیتر محلول لایز ترکیب میشود(نسبت رقیق سازی ثانویه 1:308). این محلول برای شمارش سلولهای سفید(WBC) و اندازهگیری غلظت HGB مورد استفاده قرار میگیرد.روش اندازهگیری خون رقیق شده (Prediluted):
در این روش اپراتور ابتدا 20 میکرولیتر از خون کامل را با 6/1 میلیلیتر محلول ایزوتون رقیق میسازد(نسبت رقیقسازی خارجی 1:80)، سپس 7/0 میلیلیتر از محلول رقیق شده خارجی توسط دستگاه مکش میشود و مجدداً با 5/2 میلیلیتر محلول ایزوتون رقیق میگردد(نسبت رقیقسازی اولیه در داخل دستگاه 1:366)، سپس این محلول رقیق شده اولیه به دو قسمت زیر تقسیم میگردد :
الف) 8/24 میکرولیتر از محلول رقیق شده اولیه مکش شده و مجدداًَ با 3 میلیلیتر محلول ایزوتون رقیق میگردد، (نسبت رقیقسازی ثانویه1:44274)، این محلول برای شمارشهای RBC و RLT مورد استفاده قرار میگیرد.
ب) بقیه محلول رقیق شده اولیه با 36/0 میلیلیتر محلول لایز ترکیب شده و برای شمارش WBC و اندازهگیری HGB مورد استفاده قرار میگیرد(نسبت رقیقسازی ثانویه 1:366).
هنگامی که سلولهای خون از روزنه مخصوص شمارش عبور مینمایند، به طور لحظهای تغییراتی در امپدانس و الکترود مثبت و منفی دو طرف روزنه ایجاد میشود و چون این تغییر امپدانس ارتباط مستقیمی با اندازه سلول عبور کردهدارد، میتوان امپدانسهای ایجاد شده را به نوع سلول ارتباط داد، در دستگاه سلکانتر، امپدانسهای تغییر یافته تقویت میشوند و مطابق شکل(3) دستهبندی میگردند.
باید توجه داشت که اگر چند سلول به طور همزمان از روزنه عبور نمایند، خطایی در اندازهگیری ایجاد میشود که میتوان آن را در سیستمهای سلکانتر تصحیح نمود، شایان ذکر است که عوامل به وجود آورنده این خطا عبارتند از :
1) غلظت خون مورد اندازهگیری که به کیفیت و محلول ایزوتون مورد استفاده بستگی دارد.
2) قطر روزنه (Aperture)
3) سرعت عبور سلولهای خونی از روزنه (سرعت مکش).
اندازه سلولها:
یک نکته مهم در وضعیت پالسهای الکتریکی ارتباط بین ارتفاع پالس و اندازه سلولی است که از روزنه عبور مینماید، سلولها و ذرات بزرگتر،پالسهای با ارتفاع بیشتر تولید مینمایند، خوشبختانه هر دسته از سلولها دارای اندازههای مشخص قابلپیشبینی هستند، بنابراین میتوان سلولها را از نظر اندازه آن تفکیک نمود.
محدوده طبیعی اندازه سلولهای مختلف به این صورت است :
WBC:30-400 femtoliter
RBC: 30-250 femtoliter
PLTs: 2-25 femtoliter
به دلیل تفاوت آشکار در سایز سلولهای RBC و پلاکتاین امکان به وجود آمده است که این دو نوع سلولبه طور همزمان و در یک کاپیلاری شمارش گردد. در شکل(3).a میتواند یک پلاکت و b میتواند یک سلول RBC باشد و c را میتوان یک سلول بسیار کوچکتر از یک پلاکت فرض نمود که در شمارش دستگاه قرار نمیگیرد. با تنظیم دقیق آستانه دستگاه میتوان سلولهای بسیار ریز را که میتوانند موجب ایجاد خطا در شمارش شوند، حذف کرد و بنابراین دستگاه این سلولها را از شمارش خارج کرده و آنها را در محاسبات وارد نمینماید. باید به این نکته توجه نمود که هر چند محدوده سایزبندی برای RBC و پلاکتها کاملاًمتفاوت به نظر میرسد اما در عمل، هر نوع از سلولها خود دارای یک محدوده سایزبندی مشخصی هستند، هر گاه تعداد سلولها را در برابر اندازه آنها ترسیم نماییم، توزیع سلولهای RBC و پلاکت بسیار مشابه منحنی BELL است و این دو منحنی RBC و پلاکت کنار یکدیگر قرار خواهند گرفت و در بعضی از مواقع با یکدیگر تداخل خواهند نمود. بدین منظور یک شیوه مخصوص اندازهگیری برای تفکیک سلولهای RBC از پلاکتها لازم به نظر میرسد، در دستگاههای سلکانتر پیشرفته، یک خط جداکننده برای تفکیک دو منحنیمذکور طراحی و نصب گردیده است که بدین وسیله دقت شمارش افزایش مییابد.شمارش WBC
WBC تعداد لوکوسیتهای شمارش شده در کاپیلاری WBC است :
رابطه 1) 109/L×WBC=n

WBC دیفرانسیل:
سلولهای سفید همه از یک نوع نیستند، لذا انواع متفاوت WBC رامیتوان بر اساس اندازه تفکیک نمود، جداسازی و شمارش بر اساس اندازه، فرایندی است که به وسیله شرایط محیطی صورت میپذیرد، این شرایط عبارتند از کیفیت ایزوتون، لایز و زمان بندی شمارش:
در سیستمهای سلکانتر پارشیالدیف به روش طبقهبندی الکتریکی میتوان سلولهای سفید را در سه گروه سفید دستهبندی و تفکیک نمود :
الف) لنفوسیتها، ب) میدسایزهای شامل مونوسیتها، بازوفیلها، ائوزینوفیلها ج) گرانولوسیتها. در بعضی موارد، سلولهای RBC هستهدار ممکن است در نمونه خون ظاهر شوند و با توجه به اینکه هسته این سلولها نسبت به لایز مقاوم هستند و NRBC نامیده میشوند. بجای یک WBC شمارش گردند، هر گاه NRBC به وسیله میکروسکوپ مشاهده گردد، باید مطابق فرمول زیر، تعداد WBC شمرده شده تصحیح گردد.
رابطه 2)
سه نوع سلول میدسایز در WBC وجود دارند که در منطقه بین لمفوسیتها و گرانولوسیتها قرار میگیرند، به عبارت دیگر، 85 الی 125فمتولیتر از منحنی WBC را در بر میگیرند، مونولوسیتها بزرگترین اندازه سلولهای سفید هستند که در ناحیه بالاتر از 125 فمتولیتر قرار میگیرند.
ساختار شمارش
RBC، تعداد شمارش شده اریتروسیتها در کلاپیلاری RBC است.
رابطه 3) 1012/L×RBC=n
میانگین حجم سلولهای قرمز یا MCV Mean Corpuscular) Volume)
پس از آنکه سلولهای قرمز خون شمارش شدند و منحنیمربوط به آنها ترسیم گردید، میکروپرسسور دستگاه سلکانتر جمع حجمی کل سلولهای شمارش شده را ارائه میدهد. سپس این جمع در یک فاکتور قابل تعریف ضرب میشود، تا در نهایت میانگین اندازه سلولهای قرمز در خون به دست آید،به این فاکتور قابل تعریف، ضریب کالیبراسیون MCV میگوییم، بنابراین دستگاه قادر خواهد بود، MCV را از منحنی RBC محاسبه نماید.
پارامترهای HCH، MCH و MCHC به وسیله فرمولهای ذیل محاسبه میشوند :
رابطه 4)
اصول اندازهگیری هموگلوبینغلظت هموگلوبین بر اساس روش جذب نوری(فتومتریک) در طول موج 525نانومتر اندازهگیری شده و با استفاده از یک فاکتور ثابت کالیبره میگردد و به صورت گرم در لیتر گزارش میشود.
رابطه 5) (جذبنوری نمونه/جذب نوری پلانک) خطاهای ناشی از گرفتگی روزنهها و نحوه رفع آنها:
در خون انسان، مواد و پروتئینهایی وجود دارد که میتوانند هنگام عبور از روزنه در آن گیر کرده و موجب بسته شدن روزنههای شمارش WBC و RBC شوند که در این حالت، دستگاه پیغامهایی خطا صادر کرده و بعضاً نتایج همراه با خطا یا اخطار نشان میدهند.
گرفتگی روزنهها با سیستم High – Voltage از بین میرود. ولی ممکن است در بعضی از موارد نیاز به شستشوی روزنهها با محلولهای پاک کننده خاص داشته باشیم.
در سیستمهای سلکانتر پیشرفته به محض ایجاد گرفتگی در روزنه که موجب افزایش زمان شمارش میگردد، اخطارهای خاصی به اپراتور اعلام میگردد و از روی خواسته میشود، ضمن اجرای برنامه High – Voltage، روزنهها را با محلول شستشوی مخصوص پاک نماید(اپراتور فقط با زدن چند کلید کارها را هدایت مینماید و بقیه امور توسط خود دستگاه به صورت خودکار انجام میشود).اصول اندازهگیری و محاسبه 19 پارامتر خون در دستگاه سلکانتر به روش تغییر مقاومت الکتریکی
پارامترهایی که مستقیماً توسط دستگاه شمارش و اندازهگیری میشوند و منحنی آنها ترسیم میشود، عبارتند از (/l106)WBC، (/l1012)RBC، HGB(g/l) در طول 525 نانومتر و (/l109)PLT .
پارامترهایی هم از روی منحنیهای ترسیم شده فوق محاسبه میشوند، شامل موارد زیر است :
الف) Lymph% ب) Mid% ج) Gram% د) MCV fl هـ) RDW-CV و)RDW-SD ز)MPV fl ح) PDW، همچنین پارامترهای زیر از طریق فرمولهای ریاضی محاسبه میشوند :
الف) Lymph#109 /l ب) Mid#109 /l ج) Gram#109 /l د) HCT % هـ) MCH pg و)MCHC g/l ز)PCT % میزان نمونه مورد نیاز در هر مد
در دستگاههای سلکانتر دو روش برای نمونهبرداری وجود دارد :
الف) روش Whole Blood Mode که در این روش برای اندازهگیری پارامترها به 13 میکرولیتر خون کامل نیاز داریم.
ب) روش Prediluted Mode که در این روش برای اندازهگیری پارامترها به 20 میکرولیتر خون رقیق شده نیاز داریم.
دما و رطوبت مناسب محیط برای عملکرد صحیح دستگاه سلکانتر عبارت از :
دما : بین 15 الی 35 سانتیگراد
رطوبت محیط : 10 الی 85 درصد(بدون جاذب رطوبت نظیر کولرهای گازی) همچنین محلول ضد انعقاد K2EDTA : بعنوان ضد انعقاد(Anti coagulation) مناسب برای دستگاه سلکانتر پیشنهاد میگردد.
| |
Operating Range
|
|
|
Units
|
Level
|
Parameter
|
|
109/L
|
0.0-999.9
|
WBC
|
|
1012/L
|
0.00-9.99
|
RBC
|
|
g/L
|
0-300
|
HGB
|
|
fL
|
0-250
|
MCV
|
|
109/L
|
0-3000
|
PLT
|
| |
|
Linearity
|
|
Linearity Limits
|
|
Difference
(whichever is greater)
|
Units
|
Level
|
Parameter
|
|
5%
0.3 or |
109/L
|
0.0-99.9
|
WBC
|
|
5%
0.5 or |
1012/L
|
0.00-9.99
|
RBC
|
|
5%
2 or |
g/L
|
0-300
|
HGB
|
|
5%
10 or |
109/L
|
10-999
|
PLT
|
:RBC